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ISSN : 1225-4339(Print)
ISSN : 2287-4992(Online)
The Korean Journal of Food And Nutrition Vol.27 No.1 pp.43-49
DOI : https://doi.org/10.9799/ksfan.2014.27.1.043

Effects of Extract from Fermented Flower-buds of Panax ginseng C.A. Meyer on Mouse Cytokine IL-6, TNF-αProduction

Su-Ji Jeong, Kyoung-Hee Kim, Hwa-Young Son*, Hong-Sun Yook†
Dept. of Food & Nutrition, Chungnam National University, Daejeon 305-764, Korea
*College of Veterinary Medicine, Chungnam National University, Daejeon 305-764, Korea
Corresponding Author : Hong-Sun Yook, Dept. of Food & Nutrition, Chungnam National University, Daejeon 305-764, Korea. Tel: +82-42-821-6840, Fax: +82-42-821-8887, E-mail: yhsuny@cnu.ac.kr
October 31, 2013 November 27, 2013 January 22, 2014

Abstract

Panax ginseng C.A. Meyer has been used as a traditional medicinal ingredient and the ginseng flower-buds also proved to have good medicinal properties. In this study, in order to enhance immune activities of ginseng flower-bud, the ginseng flower-bud extract was being fermented by Bacillus subtilis KCTC 1022 (BS), Lactobacillus plantarum KCTC3 and Saccharomyces cerevisiae strain CHY1011 (SC). Mice were orally administered daily for two weeks at two different concentrations (100 and 200 mg/kgB.W.). Treatment samples were water extracts of ginseng flower-buds (FD), water extracts of fermented ginseng flower-buds (FM) and controls for saline solution. Cytokine production (IL-6, TNF-α) either stimulated with LPS or not stimulated with LPS was detected by the ELISA assay when using the cytokine kit. Cytokine was statistically increased at supplemented groups with LPS in both the 100 and the 200 mg/kgB.W. and treatment with FM significantly decreased the LPS-induced TNF-α and IL-6 production more than the treatment with FD. The results of this study may suggest that supplementation with FM increases the immune function by regulating cytokine production capacity for activated macrophages.


발효 인삼꽃 추출물의 경구 투여가 마우스 사이토카인 IL-6, TNF-α의 생성에 미치는 영향

정 수지, 김 경희, 손 화영*, 육 홍선†
충남대학교 식품영양학과
*충남대학교 수의과대학

초록


    National Research Foundation of Korea
    2011-0012449

    서 론

    인삼은 일반적으로 Panax ginseng C.A. Meyer라는 식물의 뿌리를 말하며, 이 뿌리는 약용으로 이용하여 자연 건강식품 으로 널리 이용되고 있고, 약리 효능의 과학적 입증과 임상을 근거로 인식과 신뢰가 높다. 그렇기 때문에 홍삼, 홍삼추출농 축액, 파우치 등으로 가공하거나, 한약 재료로도 사용되면서 의약품 및 기능성 식품으로 그 수요가 증가하고 있다. 특히 인삼의 대표적인 약리 성분인 사포닌 ginsenoside는 TNF-α, IL-1, IL-2, IL-6, IL-12, IFN-γ 및 GMCSF와 같은 다양한 cytokines의 생산과 림프계 세포가 증식하도록 자극하는 강력 한 면역 조절 기능뿐만 아니라, 혈압 강하, 항염증 및 항산화 효과 등 매우 다양한 효능을 가지는 것으로 밝혀져 있다(Kim & Jung 1987; Jeon 등 1991; Joo & Kim 1992; Kang & Kim 1992; Kim 등 1998; Olivera 등 2001). 그러나 이와 같은 효능 은 인삼 부위 중 뿌리에 국한된 것이 대부분이며, 잎을 포함한 지상부는 거의 약용으로 이용되지 않고 있다(Attele 등 1999; Kim & Park 2003). 최근에 인삼의 잎, 줄기, 꽃, 열매의 ginsenoside에 대하여 관심이 증가하면서 이에 대한 연구로 인삼 의 잎, 줄기, 꽃에도 상당량의 ginsenoside가 존재한다고 밝혀 졌으며(Yahara 등 1976; Yahara 등 1979; Chang HK 2003; Hu 등 2008), 특히 인삼꽃은 잎과 줄기와는 달리 채취 시기별 함 량변이도 없는 것으로 나타났다(Choi 등 2009). 그럼에도 불 구하고 채종하지 않는 꽃은 인삼의 뿌리 성장을 촉진하기 위 하여 제거되므로 이들의 활용 방법에 대한 검토가 필요하다 고 생각된다.

    발효는 가장 오래된 역사를 가진 생물학의 기술로 발효유, 치즈, 김치, 된장과 같은 발효식품은 인류가 기원전 3000년경 부터 섭취해 왔고, 현재는 산업 전반에 걸친 기술 개발이 현 재에도 이루어지고 있으며, 특히 식품에서의 기술 개발이 주 류를 이루고 있다. 더욱이 최근에는 발효식품의 생리활성 작 용이 알려지면서 세계적으로 건강기능성 장수식품으로서 인 식되고 있다. 발효물질은 천연물질 고분자를 생전환시켜 저 분자 물질의 구조로 분해되어 체내 흡수율을 높일 뿐 아니라, 생체 이용률이 증가해 효과가 빠른 장점을 가지고 있으며, 화 장품의 경우도 최근 발효기법이 도입되어 기존 성분의 효능 을 증가시키고, 피부흡수율을 높인다고 보고되어 있다(Kim 등 2008). 그러므로 발효기법을 도입하여 대사에 흡수가 용이 한 형태로 사포닌 조성을 바꾼 발효인삼은 미생물 혹은 효소 를 이용한 발효를 통하여 특정 성분을 강화시키거나, 흡수가 용이하도록 가공한 인삼으로써 최근 기능성 식품으로 각광 을 받고 있다(Park 등 2006).

    최근 신체 면역체계의 기능이 저하된 경우, 식품섭취를 통 해 이들 면역 반응을 증진시킬 수 있는 다양한 연구가 요구되 고 있으며(Cho 등 1998; Cheng 등 2000), 특히 천연 식품성분 들을 공급하여 질병을 예방하고, 최적의 건강을 유지하려는 노력이 증대되고 있다(Kim & Ahn 1993; Hwang 등 2004). 이 러한 연구의 일환으로 천연물질을 대상으로 항암성에 관한 검색이 시도되고 있으며, 면역 증진에 우수한 천연식품을 소 재로 한 연구도 활발하게 이루어지고 있다(Ji 등 1997).

    따라서 본 연구에서는 발효 인삼꽃의 면역 활성 효과를 살 펴보고자 추출물을 2주간 경구 투여하고, 발효 인삼꽃 추출 물을 마우스 생체 내에 작용하였을 때 사이토카인(IL-6, TNF- α) 생성량을 측정하여 발효 인삼꽃 추출물의 면역 증진 효 과를 알아보고자 하였다.

    재료 및 방법

    1균주 배양

    발효에 사용된 균주 Bacillus subtilis KCTC 1022(BS), Lactobacillus plantarum KCTC3104(LP)는 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture, Daejeon, Korea) 및 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였으며, Saccharomyces cerevisiae 균주 중 하나인 S. cerevisiae strain CHY1011(SC)는 우수한 빵 효모균으로, BS는 Nutrient broth에서, LP는 Lactobacilli MRS broth에서, SC는 YM broth에서 배양 후 M은 30°C에서 24시간 주기로 3회 계 대 배양 후 600 nm에서 흡광도 값이 0.4~0.6(1×105 CFU/ml) 범위 안에 들게 하여 발효 균주로 사용하였다. 발효는 BS, SC 및 LP를 3:3:4의 비율로 혼합한 혼합균주(M)를 사용하였다.

    2시료의 조제

    본 연구에 사용된 인삼 꽃은 공주시 인삼 재배 농가에서 5년근 인삼의 꽃을 구입하여 사용하였으며, 인삼꽃 발효물의 제조 방법은 Fig. 1과 같다.

    20 g의 glucose와 5 g의 peptone을 1l의 3차 증류수에 넣은 후 121°C 15분으로 가압 고온 멸균하여 실온에서 서서히 식 힌 다음, 미리 활성화 시킨 혼합 발효 균주를 10 ml넣은 후 찬물에 5회 수세한 100 g의 건조 인삼꽃을 넣고, 30°C에서 24 시간 동안 배양하였다. 그 후 배양액을 8,000 rpm으로 30분 동안 원심분리시킨 후 상등액을 -75°C 심온냉동고에 12시 간 두었다가 동결건조기에 넣고 동결건조하였다. 무발효 대 조군으로, 인삼꽃 100 g당 10배량(w/v)의 증류수로 24시간 동 안 3회 추출한 후, 여과지(Whatman No. 4)로 여과한 다음 동 결건조하여 얻은 인삼꽃 물 추출물(이하 무발효 추출물)을 사용하였다.

    3시약, 배지 및 기기

    본 연구에 사용된 시약 중 균주의 배양에 사용된 배지는 YM broth, Nutrient broth 및 Lactobacilli MRS broth로 BD Diagnostic Systems(BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA) 제품을 사용하였으며, 생균수 측정에 사용된 plate count agar (PCA) 및 potato dextrose agar(PDA) 또한 BD Diagnostic Systems (BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA) 제품을 사용하였 다. Glucose는 Junsei(Junsei Chemical Co., Ltd., Japan), peptone 은 Difco(Difco Laboratories, Detroit, Mich., USA)의 것을 사용 하였다. LPS(E. coli 055:B5)는 Sigma-Aldrich (St Louis, MO)에 서 구입하여 사용하였으며, 사이토카인(IL-6, TNF-α) 정량은 invitrogen(Camarillo, CA)에서 구매한 kit를 이용했다.

    본 연구에 사용된 기기는 동결건조기(SFDSM12 -60Hz, Samwon Freezing Engineering Co., Seoul, Korea), 흡광도 측정기기인 spectrophotometer(UV-1800 spectrophotometer, Shimadzu, Kyoto, Japan)와 microplate reader(Biotek instruments Inc., Winooski, VT)가 사용되었다.

    4동물

    동물은 7주령의 C57BL/6의 수컷을 ㈜코아텍(Pyeongtaek, Korea)에서 공급받아 1주일간 실험실 환경에 적응시킨 후 실 험에 사용하였다. 실험에 사용된 동물은 실험 당일까지 사료 와 물을 충분히 공급하고, 실험실은 실온(22±2°C)과 습도 20~60%을 유지하였다. 모든 실험은 동물윤리위원회의 승인을 받았고, 실험동물의 관리 및 사용에 대한 NIH(미국국립보건 원)의 지침에 따라 수행하였으며, 동물의 처리는 국가동물복 지규정을 따랐다.

    5실험의 설계

    마우스를 임의 배치법에 의해 대조군과 투여군으로 나누 었으며, 실험군마다 8마리씩 사용하였다. 실험군은 10군이며, 대조군은 chow와 생리식염수를 투여한 군(NC), 투여군은 인 삼꽃 물 추출물과 발효 인삼꽃 추출물을 체중 kg당 100 mg/ kg과 200 mg/kg의 농도로 경구 투여한 군(GD100, GD200, GM100, GM200)까지 5군으로, 위의 5군을 절반으로 나누어 15일 째 되는 날 LPS(Sigma-Aldrich, St Louis, MO)를 단회 복강 투여 한 군(LC, LD100, LD200, LM100, LM200)을 나머지 5군으로 하였다(Table 1).

    6사이토카인(IL-6, TNF-α) 분비능의 측정

    경구 투여한 마우스는 Zoletil과 2% rompun로 마취시키고, LPS 복강 투여 3시간 후, EDTA tube를 이용해 혈장 샘플을 수집하고, 3,000 rpm에서 20분 동안 원심분리해 상층액만 분 리하여 사용했다. 혈장 내 사이토카인 분비량은 특정 IL-6, TNF-α ELISA kit(invitrogen, Camarillo, CA)를 각각 사용하였 다. ELISA는 제조사의 지침에 따라 수행되었고, 450 nm에서 흡광도(IL-6, TNF-α)의 양을 측정하였다.

    7병리조직 검사

    혈장 채취 후 흉선, 림프절, 비장, 간, 신장은 무게를 잰 후 10% 포르말린에 4°C에서 24시간 동안 고정하였다. 그 후 파 라핀에 싸고 5 µm의 두께로 자르고 H and E solution(Merck, Darmstadt, Germany)으로 염색한 후, 광학 현미경(Eclipse 80i, Nikon, Melville, VY)으로 관찰하였다.

    8통계 처리

    이상의 실험에서 얻어진 결과는 SAS(Statistic Analysis System) 통계 프로그램을 이용하여 One Way ANOVA test로 분석하였 으며, 유의적 차이가 있는 항목에 대해서는 Duncan's multiple range test로 α=0.05 수준에서 유의차 검정을 실시하였다.

    결과 및 고찰

    1IL-6 분비량

    IL-6(Interleukine-6) 분비량 결과는 Table 2에 나타내었다. LPS로 처리하지 않은 경우, 24.96에서 30.88로 유의적인 차이 가 없는 것으로 나타났다. LPS 첨가한 실험군에서는 시료를 첨가한 발효 인삼꽃 물 추출물(FM), 인삼꽃 물 추출물(FD)에 서 모두 대조군보다 낮은 IL-6 분비량을 보였고, 특히 FM에 서 100 mg/kgB.W. 농도일 때 1,631.92 pg/ml, 200 mg/kgB.W. 농도에서는 1,110.62 pg/ml로 유의적으로 낮은 IL-6 분비량을 보였다. IL-6은 간세포에서 급성 단계 단백질을 합성하고, 전 염증성 세포활성물질로 알려져 있다(Hirano 등 1986). IL-6은 면역반응과 염증 조절에 중요한 작용을 하며, 과량으로 생성 되면 류마티스 관절염, Crohn씨병 등의 염증성 질환이 발생 된다(Nishimoto 등 2000). 이를 통해 인삼꽃은 IL-6의 생성을 억제하고, 특히 발효 인삼꽃에서 항염증 효과가 있는 것을 확 인할 수 있었다.

    Lee 등(2010)은 발효한 인삼잎에서 발효 전에는 없던 Rh2, Rh1, Rg2 및 Rg3가 검출되었고, 이 ginsenoside의 대표적인 기 능성으로는 각각 암세포 증식 억제 작용, 간상해 억제 작용, 혈소판 응집 억제 작용 및 암세포 전이 억제 작용 등을 한다 고 보고되어 있다(Nam KY 1996). 본 실험실에서도 인삼꽃 무발효 추출물과 균주별 발효물의 ginsenoside 조성 및 함량 을 측정 분석하기 위해 HPLC 분석을 한 결과, 발효 전에는 미량이거나 아예 없었던 Rh1, Rb3, Rg2와 Compound K와 같 은 ginsenoside가 검출되는 것을 볼 수 있었다. 저분자의 Rh1, Rb3, Rg2뿐만 아니라, 특히 Yang 등(2007)에 의하면 Compound K는 IL-6 생성을 억제하여 항염증에 효과가 있다고 하는 것 으로 보아 발효를 통해 증가한 저분자의 사포닌이 IL-6의 생 성을 억제하여 항염증 효과를 낸 것으로 추측된다.

    2TNF-α 분비량

    TNF-α는 면역반응의 초기에 분비되는 전염증성 세포활 성물질로 천식이나 류마티스 관절염 등 여러 가지 질환의 염 증 반응 조절에 관여하는 것으로 알려져 있다(Stankiewicz 등 2002). TNF-α는 염증의 활성화, 호중구 활성화, 시상하부의 열, 간장에서의 급성단계의 단백질 합성, 근육의 이화작용, 세포 고사 등의 역할을 하지만, 다량의 TNF-α 발현은 심근 수축력 감소, 혈압 강하, 대사과정의 손상을 유발하기도 한다 (Beutler & Cerami 1989; Vilcek & Lee 1994; Eigler 등 1997). TNF-α분비량은 Table 3에 나타내었다. LPS로 처리하지 않 은 경우는 유의적인 차이가 없이 모두 낮은 값을 나타냈지만, LPS 첨가한 실험군에서는 인삼꽃 시료를 첨가한 군(FD, FM) 이 200 mg/kgB.W. 농도일 때 대조군(Control)보다 유의적으로 낮은 TNF-α 분비량을 보였고, 인삼꽃 물 추출물(FD)에서는 340.62 pg/ml로, 발효 인삼꽃 물 추출물(FM)에서는 310.60 pg/ ml로 FM에서 더 TNF-α를 억제하는 효과가 큰 것을 볼 수 있었다.

    Min 등(2010)의 꾸지뽕을 이용한 발효 연구 결과에서도, FM에서 TNF-α등 여러 가지 사이토카인의 분비를 비교한 결과, FD보다 더 억제되어 면역력이 높게 나타났다고 보고 하였다. 이 원인을 폴리페놀 성분이 발효에 의해 그 함량이 35~46% 증가한 것으로 보고 있는데, 발효에 따른 차이를 비 교한 Doh 등(2010)의 연구에서 인삼의 뿌리를 이용한 발효 결과, 총 폴리페놀 함량 측정 시 균주에 따라 차이를 보였는 데, 본 실험에서도 사용한 Saccharomyces cerevisiae 발효 추출 물에서는 높게 나타났다고 보고하였다. 또한 Kim DM(2011) 은 인삼꽃 무발효 추출물과 비교했을 때 총 페놀의 함량이 인삼꽃에서 44.22 GAE mg/g으로 월등히 높은 함량을 보였다 고 하였다. 따라서 발효를 통해서 새로 생겨난 ginsenoside뿐 만이 아니라, 폴리페놀 성분 또한 염증성 사이토카인 발현 및 생성을 조절함으로써 염증반응을 조절하는 것으로 추측 되며, 본 연구에서 확인하지 못한 발효를 통해 새로 생겨난 ginsenoside의 면역 활성에 대해서 향후 연구가 더 필요한 것 으로 보여진다.

    3체중 변화와 병리조직검사

    체중의 변화의 결과는 Table 4에 나타냈다. 어떠한 변화도 관찰되지 않았고, 추출물 투여와 관련된 이상소견 없이 정상 적인 체중의 증가가 관찰되었다. Fig. 2는 LPS로 유발한 염증 에 인한 조직 파괴의 형태학적 관찰에 의해 조직의 이상 유, 무를 관찰하여 본 결과이다. 이 두 가지 결과로 볼 때 인삼꽃 추출물 투여 시 아무런 이상이 관찰되지 않았다.

    요 약

    생체 내 실험에서 발효 인삼꽃 추출물(FM), 발효하지 않은 인삼꽃 추출물(FD)과 대조군으로 생리식염수를 2주간 마우 스 체중 kg당 100, 200 mg/kgB.W.의 농도로 마우스에 경구 투여한 후 LPS에 의해 활성화된 복강 대식세포가 분비하는 염증성 사이토카인 IL-6, TNF-α의 생성량을 측정하였다. 그 결과, IL-6는 발효 LPS로 자극한 경우, 두 가지 농도에서 모 두 처리한 군에 비해 높은 증식능을 나타내었고, LPS로 자극 한 결과, 특히 발효 인삼꽃 추출물 200 mg/kg B.W. 농도에서 유의적으로 낮은 IL-6 분비량을 보였다. TNF-α의 경우, 100 mg/kgB.W.와 200 mg/kgB.W. 두 농도 모두에서 LPS로 자극 하지 않은 경우, 낮은 증식 효과를 보여주었고, 자극한 경우, 인삼꽃 시료를 첨가한 군이 대조군보다 낮은 TNF-α 분비량 을 보였으며, FM에서 FD보다 더 TNF-α 를 억제하는 효과가 큰 것을 볼 수 있었다. 이상의 결과에 따르면 FD의 사이토카 인 IL-6, TNF-α생성 효과는 200 mg/kgB.W. 농도 투여 시 효과적으로 면역 세포와 면역 기관의 주요 기능을 증진시킬 가능성이 있을 것으로 사료된다. 이러한 연구결과를 토대로 앞 으로 인삼꽃 발효를 이용한 기능성 사료 개발과 더불어 산업적 측면에서 보다 긍정적인 효과를 얻을 수 있을 것으로 판단된다.

    감사의 글

    본 논문은 2011년도 정부(교육과학기술부)의 재원으로 한국 연구재단의 지원을 받아 수행된 기초연구사업(2011-0012449) 이며 지원에 감사드립니다.

    Figures and Tables

    Figure

    KSFAN-27-43_F1.gif

    Procedure of fermentation microorganism treatment.

    KSFAN-27-43_F2.gif
    Micrographs of (A); Thymus, (B); Lymph node, (C); Spleen, (D); Liver(H&E stain, ×100) and (E); Kidney (H&E stain, ×40).

    NC; Control, GD(100, 200); (100, 200 mg/kgB.W) water extract of ginseng flower-buds, GM(100, 200); (100, 200 mg/kgB.W) water extract of fermented ginseng flower-buds, LPS; Control stimulated with LPS, LD(100, 200); GD(100, 200) stimulated with LPS, LM1(00, 200); GM(100, 200) stimulated with LPS.

    Table

    Study design of ex vivo experiment

    1)FD; water extract of ginseng flower-buds, FM; water extract of fermented ginseng flower-buds.

    IL-6 production by activated peritoneal macrophages of mice orally administered with flower-buds of Panax ginseng for 2 weeks

    1)The data present the mean values±S.D. n=8 The different letters (a, b, c, d) within every mitogen groups are significantly different from each other at α=0.05 as determined by Duncan's multiple range test(a>b>c>d).
    2)The cytokine concentrations were determined by triplicates cultured supernatant cells and values are mean±S.D.
    3)FD; water extract of ginseng flower-buds, FM; water extract of fermented ginseng flower-buds.

    TNF-α production by activated peritoneal macrophages of mice orally administered with flower-buds of Panax ginseng for 2 weeks

    1)The data present the mean values S.D. n=8 The different letters (a, b, c) within every mitogen groups are significantly different from each other at α=0.05 as determined by Duncan's multiple range test(a>b>c).
    2)The cytokine concentrations were determined by triplicates cultured supernatant cells and values are mean S.D.
    3)FD; water extract of ginseng flower-buds, FM; water extract of fermented ginseng flower-buds.

    Weight of mice orally administered with flower-buds of Panax ginseng for 2 weeks

    1)BW: body weight, SPL: spleen, THY: thymus, LN: lymph node, LIV: liver, KID: kidney.

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